Проектирование и скрининг новых молекулярных соединений, нацеленных на дегидрогеназу лактата из микроти -микроти — паразиты и векторы

Создание базы данных структурной модификации DHNA

Основываясь на взаимодействии между соответствующими аминокислотными остатками в активном сайте BMLDH и DHNA, были внесены модификации в DHNA путем модификации позиций карбоксильных и гидроксильных групп и введя различные группы боковых цепей. Программное обеспечение Discovery Studio (V18.1.100.18065) ​​использовалось для проектирования структур малых молекул и генерации наборов этих структур. Модули «подготовка лигандов» и «минимизации лиганда» использовались для уточнения и оптимизации структурных коллекций.

Молекулярный молекулярный

Структура белков BMLDH (соглашение PDB N ° 6K13) была извлечена из базы данных белка и предварительно обработанной с использованием программного обеспечения Discovery Studio. Полученные данные использовались в качестве данных приемника для последующих анализов. Первоначально Libdock использовался для док -рецепторов и лигандов, и 100 лучших конформаций были отобраны в соответствии с их оценками. Эти мелкие молекулы, идентифицированные по их лучшим показателям Libdock, затем подвергались швартуру Cdocker. В гибком процессе швартовки ARG99 был обозначен как гибкий остаток, а 100 основных молекул были выбраны в соответствии с их оценками энергетики Cococker.

Синтез

Два соединения, TA и TB, были синтезированы по указанной сводной дороге (дополнительный файл 1: Дополнительный рис. 1).

Синтез соединения ТА

Соединение 2: к охлажденному раствору соединения 1 (19 г, 85,2 ммоль, 1 уравнение) Не,,Не-DimethylFormamide (DMF) (170 ml) at 0 ℃, chloride of Triisopropylsilyl (Tipscl) (21.4 g, 110.7 mmol, 23.7 ml, 1.3 EQ), imidazole (12.2 g, 178, 9 mmol, 2.1 EQ) and 4-Dimethylamymymy ) (2,1 г, 17,0 ммоль, 0,2 уравнения) были добавлены. Реакционную смесь оставляли нагреваться в 15-20 ℃ и взволновали в течение 6 часов.

Соединение 3: Флэш 1: часть (60 мл) составного раствора 2 (24 г, 63,23 ммоль, 1 уравнение) в тетрагидрофуране (ТГФ) (300 мл) добавляли в высушенный пламя для бутылки, содержащий магний (1,5 г, 62,1 MMOL, 0,98 уравнение) и йод (160,6 мг, 632,6 мкмоль, 127,4 мкл, 0,01 уравнения) в атмосфере азота. Смесь нагревали до 65–70 ℃, а оставшиеся 240 мл Бром-компонента добавляли со скоростью для поддержания рефлюкса. Как только добавление закончено, темный раствор вводили в 65–70 ℃ в течение 1 часа, затем охлаждали при 15–20 ℃. Коляска 2: раствор фтальского ангидрида (9,4 г, 63,3 ммоль, 1 уравнение) в ТГФ (120 мл) нагревали до 65–70 ℃. Затем раствор Flask 1 добавляли падение на 1 час и взволновали при 65–70 ℃ в течение 4 часов. Реакционную смесь охлаждали при 15-20 ℃ и погашали путем добавления HCl 2 M до отрегулированного pH до от 2 до 3 до -10 до 0 ℃.

Составленный 4: палладий на углероде (PD / C, 1,1 г, 1,7 ммоль, чистота до 10%) добавляли в раствор соединения 3 (11 г, 24,5 ммоль, 1 уксусная кислота (ACOH, 110 мл) при азота атмосфера. Суспензию дегрессировали в вакууме и несколько раз очищали водородом. Смесь вводили при водороде (40–50 фунтов на квадратный дюйм) при 60–70 ℃ в течение 24 часов. Смесь вводили при водороде (40–50 фунтов на квадратный дюйм) при 60–70 ℃ в течение 6 часов дополнительных.

Цель, составленная (TA): TBAF (1 м, 20,9 мл, 1,3 уравнения), добавляли в составной раствор 4 (7 г, 16,1 ммоль, 1 уравнение) в ТГФ (80 мл), и смеси волнули при 15 -20 ℃ за 1 час.

Соединение синтез туберкулеза

Соединение 6: Коак (8,6 г, 87,3,3 ммоль, 2 уравнения), даже если они₂ (1,3 г, 1,8 ммоль, 0,04 уравнения) добавляли в составной раствор 5 (10 г, 43,7 ммоль, 1 уравнение) в 1,4-диоксане (100 мл) в атмосфере азота. Реакционную смесь вводили при 80–85 ℃ в течение 4 часов.

Соединение 7: Соединение 6 (8 г, 28,9 ммоль, 1,4 уравнения), PD (DPPF) CL₂ (1,5 г, 2,1 ммоль, 0,1 уравнения) и k₂Сопутствующий₃ (14,6 г, 105,4 ммоль, 5 уравнение) добавляли в раствор соединения 2 (8 г, 21,1 ммоль, 1 уравнение) в 1,4-диоксане (80 мл) и ч.₂O (19 мл) под атмосферой азота. Реакционную смесь вводили в 80–85 ℃ в течение 8 часов.

Составленный 8: TBAF (1 м, 27,4 мл, 1,5 уравнения) добавляли в раствор соединения 7 (8,2 г, 18,3 ммоль, 1 уравнение) в ТГФ (80 мл), и смесь вводили при 15–20 ℃ для 2 часа.

Составной цель B (TB): NaOH (2,7 г, 68,5 ммоль, 2,5 уравнения) добавляли в составной раствор 8 (8 г, 27,4 ммоль, 1 уравнение) в MEOH (80 мл) и ч.₂O (160 мл). Смесь вводили в 15–20 ℃ в течение 3 часов.

Паразиты

А Б. Микроти Национальный институт паразитических заболеваний, Китайский центр по контролю и профилактике заболеваний (Шанхай, Китай). Этот штамм хранится в жидком азоте с добавлением диметилсульфоксида (ДМСО) в Национальную ключевую лабораторию сельскохозяйственной микробиологии, Сельскохозяйственный университет Хуажонга, Китай.

Выражение и очищение RBMLDH

Экспрессия и очистка RBMLDH проводили в соответствии с ранее установленным протоколом [19]Полем Короче говоря, бактериальная культура PET-28A-BMLDH / BL21 (DE3), хранящаяся при -80 ℃, была оттаивала и реанимирована. Для индуцирования экспрессии rbmldh, изопропилтио-β-дюймовый-Галактозид (IPTG) добавляли и культуру инкубировали в 28 ℃. После достаточного индукции клетки собирали. Затем рекомбинантный BMLDH очищали с использованием колонны аффинной хроматографии или (GE Healthcare, Uppsala, Швеция) после инструкций производителя.

Поверхностные плазмонные резонансные дозировки (SPR)

Свойства связывания RBMLDH с небольшими молекулами оценивали с использованием системы Biacore T200 (GE Healthcare, Uppsala, Швеция) через поверхностные плазмонные резонансные тесты (SPR). Сенсорная чип CM5 была вставлена ​​в систему Biacore T200 и промыта штампом PBST (рН 7,5). Чтобы активировать чип датчика, смесь 1: 1 (об. / Об.) ГСС 0,1 м и 0,4 М EDC вводили в поток 10 мкл / мин в течение 1200 с. Очищенный RBMLDH разбавляется при концентрации 25 мкг / мл в буфере ацетата натрия 10 мМ (рН 4) и иммобилизовано ковалентно на чипе CM5 с потоком 30 мкл / мин, пока он не достигнет 6100 RU. Полем Реакцию прервали путем инъекции этаноламина. Новые соединения малых молекул, первоначально подготовленные для концентрации 100 мМ, разбавляли в дополнение к PBST в конечных концентрациях 20, 10, 5, 2,5, 1,25 и 0 мкм. Протоковые ячейки 1 и 3 служили в качестве эталонных поверхностей, в то время как проточные ячейки 2 и 4 были обозначены как экспериментальные поверхности.

Анализ ингибирования ферментов

ТА и ТБ растворяли в ДМСО, чтобы создать 100 мм раствор. Система реакции, выполненная при 25 ℃, состояла в NACO₃ и Нахко₃ Тампон (рН 9,5) с общим объемом 200 мкл, содержащий 50 нг rbmldh, 1,5 мм NAD⁺10 мм Л-Кейцид лактической и переменной концентрации соединений мелких молекул. Увеличение производства NADH контролировалось спектрофотометрией в OD₃₄₀ (Оптическая плотность при 340 нм). CI₅₀ Значения для новых соединений малых молекул были рассчитаны на основе этих результатов. Конечная концентрация ДМСО не влияла на активность RBMLDH, и все переживания были выполнены в тройке.

Ингибирующий эффект ТА и ТБ против роста Б. Микроти in vitro

Mouses BALB / C были инокулированы 10⁷ Б. Микроти (100 мкл) через внутрибрюшинную инъекцию. Как только паразит достиг 60%, кровь была взята из хвоста мышей, и начальный процент паразитированных эритроцитов (СИП) разбавляли примерно на 0,8% с использованием эритроцитов здоровых мышей. TA и TB готовили в форме 100 мМ растворов запаса и разбавляли больше в градиентах концентрации 500 мкМ, 250 мкМ, 125 мкМ и 62,5 мкМ с ростом среды (HL-1 с добавлением 10 мкг / мг альбома I, 1 % Hb101, 200 мкм Л-Glutamine, 2% антибиотиков / антимикотический 100 × и 20% сыворотки скота плода). В качестве положительного контроля использовалась среда роста, без отрицательного контроля, в то время как 10 мкМ ацетологического ацетологического (DA) диманазена (DA). Культуры инкубировали в течение 72 часов до 37 ℃ в газовой смеси 2% o₂5% co₂и 93% н₂ [23, 24]Полем После инкубации был приготовлен мазок крови, окрашены в Giemsa, и была рассчитана скорость перемещения. Весь опыт был сделан в тройке.

CCK-8 Метод тест цитотоксичности

Клеточный линейный веровой линейный без микоплазмы (ATCC-CCL-81, иммортализованные клетки) был криоконцентрированным в жидком азоте с ДМСО в Национальной лаборатории сельскохозяйственных микробиологических ключей, Хуажонг Сельскохозяйственный университет, Китай. Цитотоксичность соединений TA и TB оценивали в клетках Vero с использованием теста CCK-8 (вазим). Короче говоря, клетки Vero (100 мкл, 10000 клеток / скважины) культивировали в модифицированном орле (DMEM) Dulbecco, дополненного 10% плода -бычьей сывороткой (FBS) и 100 ед / мл пенициллина — стрептомицина до 37 ℃ с 5%. CO CO₂ в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали переменными концентрациями TA (2000, 1000, 500, 250 и 125 мкм) или ТБ (800, 400, 200, 100 и 50 мкм) в течение 72 часов. После периода лечения среду, содержащей ТА и ТБ, была заменена свежей окружающей средой. Впоследствии 10 мкл раствора CCK-8 добавляли в каждую лунку, и пластину инкубировали в течение дополнительных 3 часов. Поглощение измеряли при 450 нм с использованием многофункционального ферментативного маркера (Invision, PE, USA). Решения оригинального TA и ТБ были приготовлены для концентрации 100 мм в абсолютном этаноле. Гидрохлорид доксорубицина при 40 мкм служил положительным контролем, в то время как 2% абсолютный этанол служил отрицательным контролем. Концентрация, необходимая для достижения 50% цитотоксичности (CC₅₀) Значения были рассчитаны с использованием GraphPad Prism 8, и все тесты на цитотоксичность были проведены в тройке.